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PI活細胞/死細胞雙染試劑盒*啦

更新時間:2018-07-10      瀏覽次數(shù):1953

PI活細胞/死細胞雙染試劑盒*啦

購買PI活細胞/死細胞雙染試劑盒找上海信帆生物科技有限公司,您身邊的科研專家!

Calcein-AM是一種對活細胞進行熒光標記的細胞染色試劑,發(fā)綠色熒光(Ex=490nm, Em=515nm)。因其在傳統(tǒng)的Calcein(鈣黃綠素)基礎上引入乙酰甲氧基甲酯(AM)基團,增加了疏水性,使其能夠輕易穿透活細胞膜。一旦進入細胞后,Calcein-AM(本身不發(fā)熒光)被細胞內(nèi)的酯酶剪切形成膜非滲透性的極性分子Calcein,從而被滯留在細胞內(nèi)并發(fā)出強綠色熒光。與其它同類試劑(如BCECF-AMCFDA)相比,由于Calcein, AM細胞毒性極低,是適合用于活細胞染色的熒光探針,而且不會抑制任何的細胞功能,如增殖和淋巴球的趨化性。

由于死細胞缺乏酯酶,Calcein-AM僅用于對活細胞的細胞生存能力測試和短期標記。因此,Calcein-AM常常與死細胞熒光探針如碘化丙啶(PI)等聯(lián)合使用,同時進行活細胞和死細胞的熒光雙重染色。碘化丙啶(Propidium iodide,PI)不能穿過活細胞的細胞膜,僅能穿過死細胞膜的無序區(qū)域而到達細胞核,并嵌入細胞的DNA雙螺旋從而產(chǎn)生紅色熒光(Ex=535 nm, Em=617 nm),因此PI僅對死細胞染色。由于CalceinPI-DNA都可被490 nm激發(fā),因此可用熒光顯微鏡同時觀察活細胞和死細胞。而用545 nm激發(fā),僅可觀察到死細胞。

本試劑盒的工作原理就在于Calcein-AMPI的雙重染料,來進行活細胞和死細胞的雙重染色標記,從而進行活細胞和死細胞水平的分析。根據(jù)我司優(yōu)化的實驗體系,單次就200µl細胞懸液進行染色,分別可以做5001000檢測。

PI活細胞/死細胞雙染試劑盒*啦

產(chǎn)品組分

編號組分

產(chǎn)品編號/規(guī)格

 (500T)(1000T)
ACalcein-AM Solution (2 mM)50μl50μl×2
BPI Solution1.5 mM150μl150μl×2
C10×Assay Buffer50ml100ml

運輸和保存方法

其中A組分和B組分需-20℃避光干燥保存,C組分-20℃保存,經(jīng)常使用可放在4℃保存。一年有效。

使用方法

1. 工作液的配制

1.1  1×Assay Buffer(反應緩沖液)的配制

從低溫冰箱內(nèi)取出10×Assay Buffer,根據(jù)單次用量無菌條件取出適量,用去離子水(dH2O)做10倍稀釋以得到1×Assay Buffer。

1.2  1×染色工作液的配制

1)先將低溫保存的Calcein-AM溶液 (2 mM)PI溶液(1.5 mM)回到室溫20-30min。

【注意】:次使用可對母液進行分裝,以減少反復凍融次數(shù)。

2)取5µl Calcein-AM溶液 (2 mM)15µl PI溶液(1.5 mM)加入5ml 1×Assay Buffer,充分混勻。此時得到Calcein-AM的工作液濃度為2μM,PI的工作液濃度為4.5μM。由于不同細胞系的佳染色條件不同,初次實驗建議做梯度實驗,以確定 Calcein-AMPI的適濃度。梯度篩選的原則為使用低的探針濃度得到好的熒光結(jié)果。

注意】:由于Calcein-AM的穩(wěn)定性比較差,此染色工作液必須現(xiàn)配現(xiàn)用,并且在當天用完。

2. 染色步驟

2.1 對于貼壁細胞,先用細胞刮刀或者胰酶-EDTA消化細胞,之后離心收集細胞(1000 rpm3min)。

對于懸浮細胞,直接離心(1000 rpm,3min)收集細胞。

2.2 去上清,用Assay Buffer充分清洗細胞2~3次,以充分去除殘留的酯酶活性。

2.3 Assay Buffer制備細胞懸液,使其密度為1×105~1×106細胞/ml

2.4 100µl染色工作液加入200µl細胞懸液內(nèi),混勻,37℃孵育15min。

注意】:如果需要,可延長孵育時間至30min。

2.5 熒光顯微鏡下使用490±10 nm激發(fā)濾片同時檢測活細胞(黃綠色熒光)以及死細胞(紅色熒光)。另外,使用545nm的發(fā)射濾片僅能觀察到死細胞。也可以直接在熒光酶標儀下使用合適的濾片進行檢測。

【注意】:可以使用以下方法來優(yōu)化得到兩種熒光染料的佳工作濃度。

a) 0.1%皂素或者0.1-0.5%地gao辛孵育細胞10min,或者用70%乙醇孵育細胞30min,從而制備死細胞;

b) 0.1-10µMPI溶液進行死細胞染色,以得到僅僅對細胞核染色,而不會對細胞質(zhì)染色的佳工作濃度。

c) 0.1-10µMCalcein-AM進行死細胞染色,以得到不會對細胞質(zhì)染色的佳工作濃度。然后用此濃度進行活細胞染色,去觀察是否活細胞能被染色。

注意事項

1)由于Calcein-AM對濕度非常敏感,若是Calcein-AM溶液每次取完需要量后,必須緊緊密封蓋子。建議根據(jù)單次用量,分裝密封保存。Calcein-AM工作液必須現(xiàn)配現(xiàn)用。

2)碘化丙啶(PI)有一定的致癌性,操作時一定要注意防護。若接觸到皮膚,需要立即用自來水清洗。

3)為了您的安全和健康,請穿實驗服并戴一次性手套操作。

如果您對PI活細胞/死細胞雙染試劑盒*啦感興趣,歡迎上海信帆生物科技有限公司

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