WB實(shí)驗(yàn)中關(guān)于抗體選購的幾個(gè)注意事項(xiàng)，上海信帆生物提供Western Blot檢測服務(wù)，下面我們就Western Blot幾個(gè)常規(guī)問題進(jìn)行解答！

Q：如何選擇各個(gè)公司的抗體？
A：抗體可盡量選擇進(jìn)口原裝抗體，如Abcam，CST，Santa cruz等公司的抗體。根據(jù)靶蛋白的種屬（如人，小鼠，大鼠等）以及實(shí)驗(yàn)用途（WB，免疫組化，細(xì)胞免疫熒光等）在各個(gè)公司的網(wǎng)頁上選擇合適的抗體。選擇抗體時(shí)務(wù)必注意核對(duì)基因NCBI的序列號(hào)，以防止因?yàn)榛虻膭e名等原因?qū)е沦I錯(cuò)抗體。另外再購買抗體時(shí)需注意是否提供完善的售后服務(wù)，在廠商規(guī)定的時(shí)間內(nèi)未能得到預(yù)期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可將詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)信息交給抗體公司進(jìn)行質(zhì)量投訴，一般提供充分的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)并且在保質(zhì)期內(nèi)可以得到抗體調(diào)換等售后服務(wù)。

Q：抗體使用有哪些注意事項(xiàng)？
A：使用抗體前需仔細(xì)閱讀說明書，了解抗體的保存條件以及不同用途下的推薦稀釋比例。較高濃度的抗體（>0.5mg/mL）通常性質(zhì)更穩(wěn)定，受生物試劑工藝和成本控制等因素影響，不同品牌的抗體的濃度也不相同，所以購買時(shí)應(yīng)注意比較，經(jīng)驗(yàn)不足的實(shí)驗(yàn)者往往被抗體的體積迷惑，要注意相同質(zhì)量下低濃度的抗體體積反而更大。

Q：為什么各個(gè)抗體都要進(jìn)行 WB預(yù)實(shí)驗(yàn)？
A：對(duì)WB結(jié)果有決定性影響的因素是抗體的效價(jià)和如果正確使用手中的抗體。正確使用抗體可以保證抗體效價(jià)不被過分的拮抗，與抗原更加有效的結(jié)合，從而獲得特異性和非特異性背景之間差異的大化。每一個(gè)抗體都有其特性，因此我們必須通過WB預(yù)實(shí)驗(yàn)獲得背景小，非特異性條帶少的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

預(yù)實(shí)驗(yàn)的內(nèi)容如下：

1）確定一抗的稀釋比例和孵育時(shí)間；

2）選擇合適的封閉液及封閉時(shí)間；

3）調(diào)節(jié)合適的上樣量，使內(nèi)參條帶灰度值趨于一致。

Q：半干轉(zhuǎn)和濕轉(zhuǎn)的優(yōu)缺點(diǎn)有哪些？如何選擇？
A：半干轉(zhuǎn)和濕轉(zhuǎn)兩種轉(zhuǎn)膜方式各有優(yōu)劣。濕轉(zhuǎn)適合所有的蛋白尤其分子量大的蛋白，轉(zhuǎn)膜效率佳，但對(duì)試劑消耗量較大，轉(zhuǎn)膜時(shí)間長于半干轉(zhuǎn)；半干轉(zhuǎn)適合分子量小于100KD的蛋白，省時(shí)、省試劑。

Q：什么是WB的灰度半定量分析？
A：通常用Image J 或photoshop軟件對(duì)各個(gè)樣本的目的蛋白及其內(nèi)參蛋白曝光后膠片的灰度值進(jìn)行計(jì)算，按照灰度值的高低來半定量分析各個(gè)樣品中蛋白的表達(dá)差異。

Q：WB進(jìn)行幾次重復(fù)實(shí)驗(yàn)？
A：我們常規(guī)報(bào)價(jià)的服務(wù)內(nèi)容為進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)（摸索實(shí)驗(yàn)條件）并提供一次正式實(shí)驗(yàn)WB膠片結(jié)果。預(yù)實(shí)驗(yàn)一般會(huì)對(duì)封閉條件，抗體濃度，孵育時(shí)間等條件進(jìn)行多次重復(fù)以獲得一次優(yōu)的正式實(shí)驗(yàn)結(jié)果?？蛻羧粢筮M(jìn)行2-3次的生物學(xué)重復(fù)實(shí)驗(yàn)，請(qǐng)?jiān)诤炗喓贤疤貏e說明，我們會(huì)根據(jù)工作量的增加收取相應(yīng)的費(fèi)用。

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