NADH檢測(cè)試劑盒應(yīng)該如何正確使用

上海信帆生物供應(yīng)NADH檢測(cè)試劑盒，產(chǎn)品現(xiàn)貨供應(yīng)！

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：
? NAD+/NADH檢測(cè)試劑盒(WST-8法) (NAD+/NADH Assay Kit with WST-8)是一種基于WST-8的顯色反應(yīng)，通過比色
法來檢測(cè)細(xì)胞、組織或其它樣品中NAD+ (氧化型輔酶I)和NADH (還原型輔酶I)各自的量、比值和總量的檢測(cè)試劑盒。
? NAD+/NADH以及NADP+/NADPH的傳統(tǒng)檢測(cè)方法是檢測(cè)NADH或者NADPH在340nm處吸收波長(zhǎng)的變化，該方法靈敏度較
低并易受樣品中有類似紫外吸收物質(zhì)的干擾，并且在紫外檢測(cè)過程中通常需要加大檢測(cè)樣品量以彌補(bǔ)NADH在340nm處吸
光度過小的不足，因此該傳統(tǒng)檢測(cè)方法具有很大的局限性。
? WST-8是MTT的一種升級(jí)替代產(chǎn)品，和MTT或其它MTT類似產(chǎn)品如XTT、MTS等相比有明顯的優(yōu)點(diǎn)。首先，MTT被一些脫
氫酶還原生成的formazan不是水溶性的，需要有特定的溶液來溶解；而WST-8和XTT、MTS產(chǎn)生的formazan都是水溶性的，
可以省去后續(xù)的溶解步驟。其次，WST-8產(chǎn)生的formazan比XTT和MTS產(chǎn)生的formazan更易溶解。再次，WST-8比XTT和
MTS更加穩(wěn)定，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更加穩(wěn)定。另外，WST-8和MTT、XTT等相比，線性范圍更寬，靈敏度更高。
? WST-8 和WST-1 相比，檢測(cè)靈敏度更高，更易溶解，并且更加穩(wěn)定。
? 本試劑盒使用便捷，無需分離純化細(xì)胞、組織或其它樣品中的NAD+和NADH，并且能特異性檢測(cè)NAD+和NADH，而不檢
測(cè)NADP+和NADPH。本試劑盒可以檢測(cè)含量低至0.25μM (5pmol)的NAD+或NADH，在0.25μM (5pmol)至10μM (200pmol)之
間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。
? NAD (Nicotinamide adenine dinucleotide，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸)是所有細(xì)胞中都存在的一種輔酶，包括NAD+ (氧化型)和
NADH (還原型)兩種形式。NAD+既是氧化還原反應(yīng)過程中傳遞電子的輔酶，又可以作為很多酶的底物來參與細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)。
例如Sirtuins家族的Sirt1等去乙?；妇托枰訬AD+作為底物進(jìn)行去乙?；磻?yīng)來調(diào)控蛋白的乙?；綇亩鴧⑴c細(xì)胞的
生命活動(dòng)過程。NAD+在細(xì)胞和體內(nèi)發(fā)揮著重要的功能，其合成和降解及其產(chǎn)物參與細(xì)胞凋亡、代謝調(diào)控和基因表達(dá)的調(diào)
控等，并且NAD+的減少是細(xì)胞死亡的主要因素之一。雖然NMNAT (nicotinamide mononucleotide adenylyltransferase)是
NAD+的合成酶，包括Nmnat1、Nmnat2和Nmnat3，但NAMPT (Nicotinamide phosphoribosyltransferase)通常被認(rèn)為是NAD+合
成的限速酶。NAD+在調(diào)節(jié)細(xì)胞氧化還原狀態(tài)方面的重要性以及調(diào)控信號(hào)通路及轉(zhuǎn)錄方面的功能，使得NAD+及其合成和消
耗的酶成為多種疾病的潛在藥物靶點(diǎn)。

包裝清單：
產(chǎn)品編號(hào) 產(chǎn)品名稱  包裝
0175-1    乙醇脫氫酶 220μl
0175-2     顯色液 1.1ml
0175-3     NADH 5mg
0175-4    NADH配制液 0.8ml
0175-5    NAD+/NADH提取液 60ml
0175-6    反應(yīng)緩沖液 10ml
— 說明書 1份
保存條件：
-20ºC保存，一年有效。顯色液(0175-2)和NADH (0175-3)須-20ºC避光保存。NADH配制成溶液后，須適當(dāng)分裝后-80ºC保
存。所有試劑避免反復(fù)凍融。
注意事項(xiàng)：
? 本試劑盒中的所有試劑均需要冷凍保存，請(qǐng)嚴(yán)格按照保存條件進(jìn)行保存。如果不是一次用完，為避免反復(fù)凍融導(dǎo)致產(chǎn)品失
效，請(qǐng)適當(dāng)分裝后保存。
? NADH不太穩(wěn)定，取出NADH后請(qǐng)盡快使用。如果發(fā)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不理想，很有可能是標(biāo)準(zhǔn)品發(fā)生了降解。
? 由于NAD+/NADH提取液比較粘稠，以該提取液作為稀釋液時(shí)，無論對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品還是樣品進(jìn)行稀釋，在稀釋過程中務(wù)必保證
稀釋均勻，否則易造成實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)產(chǎn)生較大波動(dòng)。
? 在樣品加樣和混勻過程中，須盡量避免產(chǎn)生氣泡，以免影響終的吸光度測(cè)定。
? 如果不能非常嚴(yán)格地控制反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間，每次檢測(cè)都需要設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)曲線。
? 如果樣品溶液中NAD+和NADH濃度過高或過低，不在試劑盒的線性檢測(cè)范圍內(nèi)時(shí)，可適當(dāng)調(diào)整樣品或者提取液的用量。
? 由于NAD+和NADH很不穩(wěn)定，在凍存過程中較易降解，所以宜盡量使用新鮮樣品進(jìn)行檢測(cè)。
? 本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于研究診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
? 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。
使用說明：
1. 樣品的準(zhǔn)備：
a. 細(xì)胞樣品的準(zhǔn)備：對(duì)于貼壁細(xì)胞，約1×106個(gè)細(xì)胞(大約相當(dāng)于6孔板一個(gè)孔長(zhǎng)滿的細(xì)胞數(shù)量)，吸凈培養(yǎng)液，用移液器加
入200μl的NAD+/NADH提取液，并輕輕吹打，以促進(jìn)細(xì)胞的裂解；對(duì)于懸浮細(xì)胞，約1×106個(gè)細(xì)胞，600g離心5分鐘，吸
凈培養(yǎng)液，用移液器加入200μl冰浴預(yù)冷的NAD+/NADH提取液，并輕輕吹打，以促進(jìn)細(xì)胞的裂解；裂解過程在室溫或
冰上操作均可。隨后12,000g，4ºC離心5-10分鐘，取上清作為待測(cè)樣品備用。
b. 組織樣品的準(zhǔn)備：冰上預(yù)冷的PBS洗滌組織后，稱取約10-30mg的組織樣品，用剪刀剪碎，置于勻漿器中，加入400μl的
NAD+/NADH提取液在室溫或冰上進(jìn)行勻漿。隨后12,000g，4ºC離心5-10分鐘，取上清作為待測(cè)樣品備用。
2. 試劑盒的準(zhǔn)備工作：
a. NADH標(biāo)準(zhǔn)品的配制：吸取655μl NADH配制液，充分溶解本試劑盒提供的5mg NADH后即得到10mM NADH標(biāo)準(zhǔn)品。
10mM NADH標(biāo)準(zhǔn)品請(qǐng)適當(dāng)分裝后-80ºC避光保存。
b. NADH標(biāo)準(zhǔn)曲線的設(shè)置：將10mM的NADH標(biāo)準(zhǔn)品用NAD+/NADH提取液稀釋成適當(dāng)?shù)臐舛忍荻龋绯醮螜z測(cè)可以設(shè)置
0、0.25、0.5、1、2、4、6、8、10μM這幾個(gè)濃度，檢測(cè)時(shí)96孔板中每孔加入20μl的標(biāo)準(zhǔn)品，相當(dāng)于每孔為0、5、10、
20、40、80、120、160、200pmol的NADH。如有必要，在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中可以根據(jù)樣品中的NADH含量對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度
范圍進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。其中濃度為0μM的點(diǎn)為空白對(duì)照點(diǎn)，僅含NAD+/NADH提取液。注意：由于NADH很不穩(wěn)定，故配
制后需盡快使用。
c. 乙醇脫氫酶工作液的配制：將乙醇脫氫酶用反應(yīng)緩沖液稀釋45倍，例如2μl乙醇脫氫酶加入到88μl的反應(yīng)緩沖液中，即
可獲得90μl的乙醇脫氫酶工作液。每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品或樣品的檢測(cè)需要使用90μl的乙醇脫氫酶工作液，請(qǐng)根據(jù)所需檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)
品和樣品的數(shù)量，配制適量的乙醇脫氫酶工作液，并注意現(xiàn)配現(xiàn)用。
3. 樣品測(cè)定：
a. 樣品中NAD+和NADH的總量的測(cè)定：吸取20μl待測(cè)樣品至96孔板中，為了減少實(shí)驗(yàn)誤差建議設(shè)置樣品的重復(fù)孔。后續(xù)
如果發(fā)現(xiàn)樣品中的NAD+和NADH的總量過高，超出標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍，則需要用NAD+/NADH提取液將樣品適當(dāng)稀釋后
再進(jìn)行檢測(cè)；總量過低時(shí)則需要加大細(xì)胞或組織樣品的用量。
b. 樣品中NAD+、NADH 的含量或者NAD+/NADH比值的測(cè)定：吸取50-100μl待測(cè)樣品于離心管中，60ºC水浴或PCR儀上加
熱30分鐘以分解NAD+。如果加熱后產(chǎn)生不溶物，則需10,000g，室溫或4ºC離心5分鐘，吸取20μl上清液作為待測(cè)樣品至
96孔板中，為了減少實(shí)驗(yàn)誤差建議設(shè)置樣品的重復(fù)孔。后續(xù)如果發(fā)現(xiàn)樣品中的NAD+或NADH的含量過高，超出標(biāo)準(zhǔn)曲
線的范圍，則需要用NAD+/NADH提取液將樣品適當(dāng)稀釋后再進(jìn)行檢測(cè)；含量過低時(shí)則需要加大細(xì)胞或組織樣品的用量。
c. 請(qǐng)參考下表使用96孔板設(shè)置空白對(duì)照孔、標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣品孔。加入乙醇脫氫酶工作液后充分混勻。

e. 如果希望更加精確地來表述NAD+和NADH總量或各自的含量，可以將樣品用BCA法測(cè)定蛋白濃度。終用單位蛋白量中NAD+和NADH總量或各自的含量來比較精確地進(jìn)行表述。 

NADH檢測(cè)試劑盒應(yīng)該如何正確使用