總超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒(NBT 核黃素微板法)的產(chǎn)品簡介

產(chǎn)品簡介：

超氧化物岐化酶(Superoxide Dismutase, SOD)是含金屬輔基的酶，能催化超氧化物陰離子發(fā)生岐化作用，生成過氧化氫(H2O2)和氧氣(O2)，是生物體內(nèi)一種重要的抗氧化酶，由于超氧自由基是不穩(wěn)定的的自由基，壽命極短，SOD 活性一般用間接方法測定，并利用各種呈色反應(yīng)來測定 SOD 活力，其中顯色劑有 NBT(唑藍四氮)、WST-1、WST-8 等?？偝趸锲缁?SOD)檢測試劑盒(NBT 核黃素微板法)(Total Superoxide Dismutase Assay Kit with NBT)是一種基于 NBT 的光還原反應(yīng)，所以又稱作 NBT 光還原法，檢測原理是在有氧化物質(zhì)存在下核黃素被光還原，在有氧條件下，被還原的核黃素極易再氧化產(chǎn)生超氧陰離子自由基(O2.-)，O2.-可將氮藍四唑還原為藍色的甲腙，后者在 560nm處有強吸收，而 SOD 可清除超氧陰離子(O2.-)，從而抑制了甲腙的形成。于是光還原反應(yīng)后，反應(yīng)液藍色愈深，說明 SOD 活性愈低，反之酶活性愈高，據(jù)此通過酶標(biāo)儀比色分析就可以計算出樣品中總超氧化物岐化酶活性水平。本方法是利用 SOD 抑制 NBT 在光照下的還原作用來確定酶活性大小，可用于檢測植物、組織、細(xì)胞、血清或其它樣品中 SOD 活性。該試劑盒僅用于科研領(lǐng)域，不適用于臨床診斷或其他用途。

自備材料：

1、生理鹽水或 PBS

2、電子天平、剪刀、低溫冰箱或制冰機、冰袋、勻漿器或研缽、離心機、離心管、小試管、 光照培養(yǎng)箱光源或 40W 熒光燈或日光燈、測光儀(照度計)、酶標(biāo)儀、96 孔板

操作步驟(僅供參考)：

1、樣品處理：

①血漿或含紅細(xì)胞的樣品：從待測樣品中分理出的血清或血漿不應(yīng)有溶血，如果含有應(yīng)去除紅細(xì)胞后檢測，如超過檢測范圍，用 SOD 提取試劑稀釋后檢測；血清去除紅細(xì)胞的

簡易方法如下：用抗凝管收集血液，顛倒混勻，取至少 500μl 全血，4℃ 3000r/min 離

心 5min，轉(zhuǎn)移上清至另一新的 1ml 離心管中，適量生理鹽水稀釋后待測，亦可采用紅細(xì)胞裂解液去除紅細(xì)胞，如 ACK 紅細(xì)胞裂解液等。

②組織樣品：動物用含有 20U/ml Heparin 的生理鹽水(0.9% NaCl containing 20U/ml

Heparin)灌流清除血液后獲取組織樣品，按照每 100mg 組織加入 500μl SOD 提取試劑

的比例，用玻璃勻漿器在 4℃或冰浴勻漿，4℃ 4000r/min 離心 10min，取上清液(SOD

粗提液)用于酶活性的測定。

③細(xì)胞樣品：對于貼壁細(xì)胞，由于后續(xù)用于酶活性的測定，避免使用胰-酶消化細(xì)胞，可以使用細(xì)胞刮或 EDTA 處理細(xì)胞并收集細(xì)胞，細(xì)胞用無菌的 PBS 或生理鹽水洗滌 1 次，按照每 106細(xì)胞加入 300~500μl SOD 提取試劑的比例，用玻璃勻漿器在 4℃或冰浴勻漿，4℃ 10000r/min 離心 10min，取上清液(SOD 粗提液)用于酶活性的測定。

④植物樣品：準(zhǔn)確稱取植物材料(果肉或者去葉脈的葉片)0.4g，剪碎，置于 4℃預(yù)冷的研缽或勻漿器中，加入預(yù)冷 SOD 提取試劑 1ml，低溫研磨至勻漿后轉(zhuǎn)移至離心管，用 3ml

SOD 提取試劑沖洗研缽或勻漿器并轉(zhuǎn)入離心管，加提取試劑至總體積為 4ml，4℃ 4000r/min 離心 20min，上清液為酶提取液，上清液可用于 SOD 的檢測。注意：如果

SOD 酶活性較低，應(yīng)相應(yīng)減少提取試劑的總體積，以便提高 SOD 酶的濃度。

⑤上述樣品準(zhǔn)備完畢后可以用 BCA 法測定蛋白濃度，通常 10~20μg 蛋白的細(xì)胞或組織 勻漿液樣品其中的 SOD 平均活力約 1 個活力單位(不同細(xì)胞和組織的差異會比較大，該活力范圍僅作為初步的參考)；每種樣品準(zhǔn)備 20~100μg 蛋白量通常已經(jīng)足夠用于后續(xù)檢測，根據(jù)蛋白濃度和預(yù)計的蛋白使用量，用該試劑盒提供的 SOD 提取試劑適當(dāng)稀釋樣品，例如小鼠肝臟組織 10%勻漿液(組織和勻漿液的重量比為 10%)上清，通常需要稀釋 10~100 倍，準(zhǔn)備好的樣品如果當(dāng)天測定，可以冰浴保存；如果當(dāng)天不能完成測定，可以-20℃凍存，但建議盡量當(dāng)天完成測定。

2、(選做)準(zhǔn)備 SOD 標(biāo)準(zhǔn)品：需自備 SOD 標(biāo)準(zhǔn)品，用本試劑盒提供的 SOD 提取試劑將 SOD標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至如下系列濃度：200、100、50、20、10、5、2U/ml，各取 20μl 參考樣品進行檢測。注意：為避免稀釋后 SOD 酶活性的下降， SOD 標(biāo)準(zhǔn)品宜現(xiàn)稀釋現(xiàn)使用，本試劑盒對于 SOD 的檢測并不需要 SOD 作為標(biāo)準(zhǔn)品，但可使用 SOD 標(biāo)準(zhǔn)品作為陽性對照或作為對 SOD 活性定量的參考。

3、選取合適的光源：在光照培養(yǎng)箱或日光燈下，用光度儀測定光度值為 3500~4000Lx 的

適合光照反應(yīng)的位置，做出標(biāo)記。

4、配制 NBT 工作液：將 Met 緩沖液與 NBT 溶液按 23:3 的比例混合即可。

5、SOD 加樣：參考下表使用 96 孔板設(shè)置空白對照孔、光照對照孔、測定孔，在低光強條件下按下表依次加入待測樣品和其它各種溶液，加入 FD 溶液后充分混勻。注意：加入

FD 溶液后反應(yīng)即會開始，在低光強條件下用排槍操作可減小各孔間因加入試劑的時間先后差異而導(dǎo)致的誤差。

6、SOD 測定：混勻，取空白對照孔置于暗處，其他各孔置于 4000Lx 日光下反應(yīng) 20min，

各孔受光情況應(yīng)一致，溫度高時時間可縮短，低時延長；反應(yīng)結(jié)束后，以不照光的空白對照孔調(diào)零，用酶標(biāo)儀測定 560nm 處吸光度。

計算：

SOD 活力單位的定義：以抑制 NBT 光化還原的 50%為一個酶活性單位(U)。

液體中總 SOD 活力(U/ml)=(A 光照－A 測定)/(50%×A 光照×VT)

組織、細(xì)胞勻漿液中總 SOD 活力(U/g)=(A 光照－A 測定)×V/(50%×A 光照×VT×W)

血液中總 SOD 活力(U/gHb)=(A 光照－A 測定)×V×C/(50%×A 光照×VT×Hb)

式中：A 光照=光照對照孔的吸光度

A 測定=測定孔的吸光度

V=樣品液總體積(ml)

VT=測定時樣品所用體積(ml)

W=樣品鮮質(zhì)量(g)

C=1ml/采血量(ml)

Hb=血紅蛋白含量(gHb/ml)

注意事項：

1、 上述低溫試劑避免反復(fù)凍融，以免失效或效率下降。待測樣品-70℃可保存 1 個月，需注意反復(fù)凍融會導(dǎo)致 SOD 部分失活。

2、 植物中的多酚類物質(zhì)會引起酶蛋白不可逆沉淀，使酶失去活性，因此在提取 SOD 酶時，必須添加多酚類物質(zhì)的吸附劑，將多酚物質(zhì)除去，避免酶蛋白變性失活。SOD 提取試

劑含有 PVP 等成分，可有效去除多酚類物質(zhì)。SOD 提取試劑不夠用可以用磷酸鈉緩沖液(0.05M,pH7.8)替代。

3、 細(xì)胞或組織等樣品制備時，不能采用含有 Triton X-100 等去垢劑的溶液，否則會干擾本試劑盒的檢測。

4、 抗氧化物會對本試劑盒的檢測產(chǎn)生干擾，例如 0.1mM ascorbic acid，5mM GSH 都

會使測定出來的吸光度顯著升高。

5、 對于植物樣品，研磨處理應(yīng)迅速，以免 SOD 酶活下降，盡量在冰浴條件下處理。

6、 如果用分光光度計，比色杯光徑應(yīng)為 1cm，加入的上清及試劑量應(yīng)根據(jù)比色杯的最小

要求體積而定。

7、 所用離心管或 96 孔板應(yīng)潔凈透明，透光性好。

8、 一般要求各孔受光情況一致，所有反應(yīng)管應(yīng)排列在與日光燈燈管平行的直線上。

9、 反應(yīng)溫度控制在 25℃，視酶活性高低適當(dāng)調(diào)整反應(yīng)時間；溫度較高時，光照時間應(yīng)縮

短；溫度較低時，光照時間相應(yīng)延長。

10、 如果無 4000Lx 日光，可 200W 在 10~12cm 處，照射 20min；超凈工作臺 5cm 處光強約 800~1000Lx，,照射 30~40min；強太陽光下一般光強可達 30000Lx，照射 5~15min，一般不建議直接用太陽光。

11、 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

有效期：6 個月有效，4℃運輸和保存。

總超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒(NBT 核黃素微板法)的產(chǎn)品簡介