惡性腫瘤對(duì)人類的健康有極大的危害,其發(fā)病率呈逐年上升的趨勢(shì)。腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移依賴于新生血管的形成,血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)在腫瘤新生血管形成中起關(guān)鍵作用。

   因此抑制VEGF的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有可能抑制血管新生,并進(jìn)一步抑制腫瘤生長。

   本實(shí)驗(yàn)預(yù)構(gòu)建可誘導(dǎo)的VEGF的原核表達(dá)體系,以大量制備VEGF融合蛋白,為下一步制備VEGF單克隆抗體,及研究其抗腫瘤作用奠定了基礎(chǔ)。方法:根據(jù)VEGF165cDNA序列和原核表達(dá)載體pET-15b多克隆位點(diǎn)序列的特點(diǎn),設(shè)計(jì)引物。以大腸癌組織總RNA為模板,通過RT-PCR擴(kuò)增得到VEGF165全長片段(576bp)。將VEGF165目的基因片段的PCR產(chǎn)物進(jìn)行低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳,采用小量膠回收試劑盒進(jìn)行回收純化。將載體質(zhì)粒pET-15b轉(zhuǎn)化入感受態(tài)E.coli DH5α,采用堿裂解法小量抽提載體質(zhì)粒。以限制性內(nèi)切酶BamHI及NdeI對(duì)目的基因及載體質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切,酶切反應(yīng)產(chǎn)物分別行低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳,回收純化VEGF165目的基因片段和pET-15b載體片段。將VEGF165目的基因片段和pET-15b載體片段在T4DNA連接酶的作用下連接,構(gòu)建pET-15b/VEGF165重組表達(dá)質(zhì)粒。用連接反應(yīng)液轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coli DH5α,轉(zhuǎn)化后進(jìn)行氨芐青霉素篩選,陽性克隆菌落即為含有重組表達(dá)質(zhì)粒的重組工程菌。對(duì)重組工程菌進(jìn)行小量培養(yǎng),小量抽提重組表達(dá)質(zhì)粒,用BamHI及NdeI進(jìn)行雙酶切鑒定和測序鑒定,以檢查重組表達(dá)質(zhì)粒中VEGF165目的基因片段的核苷酸序列是否發(fā)生改變以及閱讀框架是否正確。鑒定正確的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)型宿主菌BL21 (DE3),篩選后即得到VEGF165特異表達(dá)工程菌。挑取工程菌的單克隆菌落,接種于含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中,37℃振蕩培養(yǎng)至菌液OD600=0.4~0.6,加入PITG誘導(dǎo)培養(yǎng)1~8h,收集菌體,加入2×SDS凝膠加樣緩沖液,超聲破菌,對(duì)誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物分別進(jìn)行SDS-PAGE和Weestn blot分析。確定表達(dá)后對(duì)誘導(dǎo)條件進(jìn)行優(yōu)化,并確定融合蛋白表達(dá)部位。其后大量誘導(dǎo)VEGF165融合蛋白表達(dá),收集、洗滌包涵體,以8mol/L尿素溶解后復(fù)性,將復(fù)性液經(jīng)過HisPrep FF 16/10親和層析柱以親和層析的方法獲得純化的VEGF165融合蛋白。結(jié)果:重組表達(dá)質(zhì)粒pET-15b/VEGF165經(jīng)特異的雙酶切鑒定結(jié)果提示,各酶切片段實(shí)際大小與理論大小基本一致。測序結(jié)果也表明,重組表達(dá)質(zhì)粒中VEGF165目的基因片段的核苷酸序列*正確,閱讀框架無誤,重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功。表達(dá)工程菌誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析表明,誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物中均有相應(yīng)的VEGF165重組融合蛋白表達(dá),其表達(dá)水平較高,并為包涵體表達(dá)。進(jìn)一步的經(jīng)Western blot鑒定結(jié)果顯示,VEGF165重組融合蛋白能與VEGF多克隆抗體特異結(jié)合,確實(shí)為我們要表達(dá)的目的蛋白。確定了zui適宜的表達(dá)條件為:0.5mmol/L IPTG,37℃,誘導(dǎo)時(shí)間4~5h。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)HisPrep FF 16/10親和層析柱親和層析可分離純化得VEGF165融合蛋白。

    結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了VEGF165基因的原核表達(dá)載體,克隆的VEGF165基因在E.coli BL-21(DE3)中得到了穩(wěn)定表達(dá),并分離純化得高純度的VEGF165重組融合蛋白。pET-15b/VEGF165原核表達(dá)載體的構(gòu)建和誘導(dǎo)表達(dá)及分離純化的成功,為下一步大量制備VEGF165目的蛋白,研制VEGF單克隆抗體,及研究其抗腫瘤作用奠定了基礎(chǔ)。