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ELISA實驗代測:ELISA免疫標記技術實驗原理

更新時間:2016-03-09      瀏覽次數(shù):2569

ELISA實驗代測:ELISA免疫標記技術實驗原理

免疫標記技術是將一些既易測定又具有高度敏感性的物質(zhì)標記到特異性抗原或抗體分子上,通過這些標記物的增強放大效應來顯示反應系統(tǒng)中抗原或抗體的性質(zhì)與含量。常用的標記物包括熒光素、酶和放射性核素等,用這3種標記物進行標記的免疫檢測技術被稱為3大免疫標記技術。目前,使用的免疫標記物還有化學發(fā)光物質(zhì)、鐵蛋白和膠體金等。

1.原理

辣根過氧化物酶(HorserADIsh Peroxidase, HRP)

辣根過氧化物酶 (horse radish peroxidase,簡稱HRP,EC.1.11.1.7)是植物中研究得zui深入的一種過氧化物酶,早在20世紀30年代就有人著手從辣根中分離此酶,以后又制備出結(jié)晶。本實驗是以辣根為原料,經(jīng)過水的抽提,硫酸銨和丙酮分級分離,再經(jīng)鋅離子純化,透析除鹽,冰凍干燥,便可得到高純度的辣根過氧化物酶。

辣根過氧化物酶是一種含亞鐵血紅素的蛋白質(zhì),HRP廣泛分布于植物界,它是由無色的酶蛋白和棕色的鐵卟啉結(jié)合而成的糖蛋白,糖含量18%。HRP由多個同功酶組成,Mr在40000左右,等電點7.2。溶于水,溶解度為5%(W/V),溶液呈棕紅色,透明。酶催化的zui適PH因供氫體不同而稍有差異,但多在pH5左右。酶溶于水和58%以下的硫酸銨溶液。HRP可溶于0.58飽和度以下的硫酸銨溶液,而0.62飽和度以上則不溶。該酶zui適pH7.0(對愈創(chuàng)木酚為氫給體而言)。在室溫下,HRP幾周內(nèi)穩(wěn)定,加熱到63℃,在15min內(nèi)穩(wěn)定。氧化還原電勢很低,pH6.08時,E 0 =-0.2070V,pH為7.71時,E′0 =-0.2787V。HRP的輔基和酶蛋白zui大吸收光譜分別為403nm和275nm,一般以OD403nm/OD275nm的比值RZ(德文Reinheit Zahl)表示酶的純度。* ?# p. n2 ~1 w. X3 b

酶標記物包括酶標記抗原、酶標記抗體和酶標記SPA等。酶標記物質(zhì)量的好壞直接關系到免疫酶技術的成功與否,因此被稱為關鍵的試劑。酶標記物中zui常用的是酶標記抗體,它是將酶與特異性抗體經(jīng)適當方法連接而成。酶標記抗體的質(zhì)量主要取決于純度好、活性強及親和力高的酶和抗體,其次要有良好的制備方法。目前,高質(zhì)量的酶(如辣根過氧化物酶,簡稱HRP)國內(nèi)已有商品供應。高質(zhì)量的抗體則可通過提取純化而獲得。在制備方法上,宜選用產(chǎn)率高、不影響結(jié)合物的活性和不混雜干擾性物質(zhì)且操作簡便易行的方法。

酶制劑及其底物

凡無毒性又能呈現(xiàn)有色化學反應的酶,原則上均可作為標記用。但作為標記抗體用的酶應滿足下列要求:

(1)來源方便,易于純化;

(2)比活性高,性質(zhì)穩(wěn)定;

(3)酶活性和量能

用簡單方法測定。目前在免疫酶技術中常用的酶為辣根過氧化物酶(HRP)和鹼性磷酸酶(AP),其次還有葡萄糖氧化酶,β-半乳糖苷酶、溶菌酶和蘋果酸脫氫酶等。

由于辣根過氧化物酶(Horseradish Peroxidase, HRP)比活性高,穩(wěn)定,分子量小,純酶容易制備,所以zui常用。HRP廣泛分布于植物界,辣根中含量高,它是由無色的酶蛋白和棕色的鐵卟啉結(jié)合而成的糖蛋白,糖含量18%。HRP由多個同功酶組成,分子量為40,000,等電點為PH3~9,酶催化的zui適PH因供氫體不同而稍有差異,但多在PH5左右。酶溶于水和58%以下飽和度硫酸銨溶液。HRP的輔基和酶蛋白zui大吸收光譜分別為403nm和275nm,一般以OD403nm /OD275nm的比值RZ(德文Reinheit Zahl)表示酶的純度。高純度的酶RZ值應在3.0左右(zui高可達3.4)。RZ值越小,非酶蛋白就越多。值得注意的是,純度并不表示酶活性,如當酶變性后,RZ值仍可不變。

HRP的催化反應需要底物過氧化氫(H2O2)和供氫體(DH2)。供氫體多為無色的還原型染料,通過反應可生成有色的氧化型染料(D)。酶促反應的過程如下:

HRP2 ~2 y( w9 E+ M

DH2+H2O2────→D+2H2O

供氫體的種類很多,形成的產(chǎn)物特點不一。如DAB(3.3-二氨基聯(lián)苯胺)的反應產(chǎn)物為不溶性沉淀物,并有電子密度,故適宜于做免疫酶染色或電鏡觀察。S(5-氨基水楊酸)早期曾用于ELISA,但其溶解度不夠大,且空白孔不易控制到無色,現(xiàn)已很少應用。OT(鄰聯(lián)甲苯胺)的特點是能產(chǎn)生鮮艷的藍綠色產(chǎn)物且靈敏度較高,但反應中受溫度影響較大,而且由于產(chǎn)物不穩(wěn)定,需要在短時間內(nèi)進行測定。目前用得較廣泛和較滿意的供氫體是:OPD(鄰苯二胺)和TMB(四甲基聯(lián)苯胺)。前者形成的產(chǎn)物為深桔黃色或棕色,后者產(chǎn)物為藍綠色,二者的可溶性均好,在避光處顏色穩(wěn)定,空白可近于無色,靈敏度上據(jù)報道后者比前者可高4倍以上。另外,還有一種供氫體稱ABTS[2, 2-邊氮基-雙(3-乙基苯并噻吡咯啉-6磺酸)],其反應產(chǎn)物呈藍綠色,且靈敏度和穩(wěn)定性均好。尤其是在致癌的潛在可能性方面,ABTS與TMB皆是值得被優(yōu)選的供氫體。

由于HRP的底物H2O2本身又是酶的抑制劑,因此酶促反應中使用的H2O2不能過量。應控制在經(jīng)較短時間反應后呈色即達高峰(說明H2O2已消耗殆盡)。這樣即使再延長時間也不會增加反應產(chǎn)物的顏色。

酶與抗體交聯(lián)的方法有許多種,根據(jù)酶的結(jié)構(gòu)不同可采用不同的方法。對于制備HRP結(jié)合物,可用戊二醛二步法和過碘酸鈉法。常用過碘酸鹽氧化法,這種方法法只適用于含糖量較高的酶。過碘酸鈉將HRP分子表面的多糖氧化為醛基,醛基與抗體分子上的氨基形成Schiff堿而結(jié)合。后者可進一步用NaBH4(或乙醇胺)還原生成穩(wěn)定的酶標記抗體。

ELISA實驗代測:ELISA免疫標記技術實驗原理

2.實驗步驟

HRP的制備

1).水提取:稱取5kg用水沖刷干凈的鮮辣根(辣根皮中亦含有豐富的HRP),用菜刀切成小碎塊,在絞肉機中絞碎1~2次。碎渣漿用1倍體積的水低溫下攪拌提取過一夜(亦可采用高速抽提法)。次日用甩干機(或離心機)甩干,收集濾液,碎渣再用1/4倍體積水浸泡提取1次,合并2次濾液,測得總體積。

2).硫酸銨分級分離:在不斷攪拌下,每1000mL濾液中慢慢加入226g硫酸銨粉末(相當于0.40飽和度,0℃),大約在1~2h內(nèi)加完,置冷室中放置過一夜。次日將上清液小心地用虹吸管移出,下面混濁液以3 000r/min離心15min,棄沉淀,合并上清液。再按每1000mL上清液加258g硫酸銨粉末(0.8飽和度)隨加隨攪拌,當硫酸銨全部溶解后,置冷室過一夜。次日,虹吸出上清液,沉淀部分在冰凍離心機中以13000r/min離心20min,棄去上清液,收集沉淀。將沉淀懸浮于100~150mL蒸餾水中(加水量要使沉淀全部溶解為止),分裝于透析袋內(nèi),放在流動自來水中進行透析1~2天,直到硫酸銨透析完畢為止(可用5%乙酸鋇溶液或奈氏試劑進行檢查)。然后改換成用蒸餾水透析,中間更換2~3次,用0.1mol/L硝酸銀溶液檢查透析外液無氯離子為止。將透析液合并,在冰凍離心機中以4 000r/min離心15min,棄去沉淀,量上清液的體積。

3).丙酮分級分離:將上清液倒入燒杯并置冰鹽浴中,在不斷攪拌下,用細滴管沿杯壁加入1倍體積預冷至-15℃的丙酮,放置片刻,在冰凍離心機中以4000r/min離心15min,棄去沉淀。上清液再加入0.8體積(按原上清液體積)-15℃丙酮,(操作同上),靜置后,在冰凍離心機中離心收集沉淀。將沉淀溶于少量蒸餾水中,透析除去丙酮??傻肦Z值近于1的酶溶液。

4).精制:將上步酶液適當稀釋,滴加1mol/L硫酸鋅溶液,使酶液中鋅離子濃度為10 -3 mol/L,5 000r/min離心10min,得上清液。再將沉淀用少量蒸餾水洗滌,離心,洗液與清液合并,分裝于透析袋內(nèi),用水透析除鹽,用微孔濾膜過濾,進行真空冰凍干燥(約得20mg),產(chǎn)品呈米黃色纖維狀松軟物,HRP產(chǎn)品的RZ值可達3.0左右,置真空干燥器中低溫保存。

(1)戊二醛二步法)

1) 原理:戊二醛為一種雙功能試劑,通過其醛基分別與酶和免疫球蛋白上的氨基共價結(jié)合,形成酶-戊二醛-免疫球蛋白結(jié)合物。

2)標記步驟:

(1) 稱取HRP25mg溶于1.25%戊二醛溶液中,于室溫靜置過一夜

(2) 反應后的酶溶液經(jīng)Sephadex G-25層析柱,用生理鹽水洗脫。流速控制在1ml/1分鐘,收集棕色流出液。如體積大于5ml,則以PEG濃縮至5ml。放置25ml小燒杯中,緩慢攪拌。

(3) 將待標記的抗體12.5mg用生理鹽水稀釋至5ml,攪拌下逐滴加入酶溶液中。

(4) 用1M PH9.5碳酸緩沖液0.25ml,繼續(xù)攪拌3?小時。)

(5) 加0.2M賴氨酸0.25ml,混勻后,置室溫2小時。

(6) 在攪拌下逐滴加入等體積飽和硫酸銨,置4℃1小時。

(7) 3000rpm離心半小時,棄上清。沉淀物用半飽和硫酸銨洗二次,zui后沉淀物溶于少量0.15M PH7.4的PBS中。

(8) 將上述溶液裝入透析袋中,對0.15M PH7.4的PB緩沖鹽水透析,去除銨離子后(用萘氏試劑檢測),10,000rpm離心30分鐘去除沉淀,上清液即為酶結(jié)合物,分裝后,冰凍保存。

3)結(jié)果判定:

(1) 定性及效價滴定:用特異性抗原(或抗體)同酶標記抗體(或抗免疫球蛋白抗體)作雙向瓊脂擴散試驗或免疫電泳試驗。然后用酶的底物使沉淀弧顯色,可初步鑒定其活性。zui后以直接ELISA法(或在正式實驗系統(tǒng)里)對酶結(jié)合物進行滴定( 見本節(jié) (三)工作濃度的選擇)。

(2) 定量和克分子比值測定:可用分光光度計測定(光程1cm)。

酶量(mg/ml)=OD403nm×0.48

IgG量(mg/ml)=OD280nm-OD403nm×0.42)×0.94×0.62& I3 X) m+ {) X- E$ M

酶量(mg/ml)   IgG量(mg/ml)   酶量

克分子比值=──────── ÷ ─────── = ─── × 49

40,000       160,000   IgG量

(3) 本法標記步驟比較簡單,重復性好。缺點是酶的利用率低,一般只有2~4%的酶與蛋白質(zhì)結(jié)合。

4)試劑及器材:

(1) 0.1M PH6.8磷酸緩沖鹽水(PBS):取0.2M Na2HPO4 49ml, 0.2M NaH2PO4 51ml,NaCl1.8克,加蒸餾水至200ml。

(2) 1.25%戊二醛液:取25%戊二醛50ml與PH6.8的PBS1ml混合。

(3) 1M PH9.5碳酸鹽緩沖液:取1M碳酸鈉3ml與1M碳酸氫鈉7ml混合。

(4) 0.2M賴氨酸溶液:稱賴氨酸29.2mg溶于0.01M PH9.5碳酸緩沖液1ml中。

(5) 0.15M PH7.4 PBS及生理鹽水。

(6) PH7.8飽和硫酸銨溶液及半飽和硫酸銨溶液。

(7) 萘氏試劑及聚乙二醇(PEG,MW2000)。

(8) 純化的特異性抗體或抗Ig抗體。

(9) HRP(RZ>3.0)。

(10) Sephadex G-25層析柱(2cm×50cm)。

(11) 攪拌器,分光光度計,離心機。

(12) 透析袋,大、小燒杯,試管,吸管等。

r& i% D. }& q: Z K9 e! E0 d

(2)簡易過碘酸鈉法% E0 O+ v: s2 T

本法是以NaIO4先將HRP表面的糖分子氧化成醛基,然后再與Ig上的氨基相結(jié)合,所獲酶標記抗體的產(chǎn)率高,將近70%的HRP和Ig結(jié)合,99%的Ig與酶結(jié)合,酶與Ig的活性無重大損失,是目前zui常用的方法。

1)原理:

經(jīng)典的過碘酸鈉法中需采用二硝基氟苯封閉HRP上殘留的α-和ε氨基基以避免酶分子之間的交聯(lián)。后來Wilson等改用在低PH下使NaIO4氧化HRP,從而省去了二硝基氟苯封閉HRP步驟。HRP經(jīng)NaIO4氧化后形成的醛化酶可與抗體分子的氨基相連,形成斯夫氏鹼,后者可進一步用NaBH4(或乙醇胺)還原生成穩(wěn)定的酶標記抗體。

8 n% @9 _& U8 s6 V2)標記步驟:

(1) 稱取5mgHRP溶解于1ml蒸餾水中。

(2) 于上液中加入0.2ml新配的0.1M NaIO4溶液,室溫下避光攪拌20分鐘。

(3) 將上述溶液裝入透析袋中,對1mM PH4.4的醋酸鈉緩沖液透析,4℃過一夜。

(4) 加20μl 0.2M PH9.5碳酸鹽緩沖液,使以上醛化桯RP的PH升高到9.0~9.5,然后立即加入10mg IgG(抗體,或SPA5mg)在1ml 0.01M碳酸鹽緩沖液中,室溫避光輕輕攪拌2小時。

(5) 加0.1ml新配的4mg/ml NaBH4液,混勻,再置4℃2小時。

(6) 將上述液裝入透析袋中,對0.15M PH7.4 PBS透析,4℃過一夜。

其余步驟(純化)同戊二醛標記步驟的(6)、(7)、(8)。

3)結(jié)果判定:

除標記物IgG量的計算,略有不同以外,其余均同戊二醛法。

IgG量(mg/ml)=(OD280nm-OD403nm×0.3)×0.62

4)試劑及器材:

(1) 0.1M NaIO4:稱取241mg高碘酸鈉(廣州化學試劑廠,批號830602)溶于蒸餾水10ml中。

(2) 1mM PH4.4醋酸鈉緩沖液

0.2M NaAc (1.361克/50ml) 3.7ml

0.2M HAc (0.601ml/50ml) 6.3ml

加蒸餾水至2,000ml。

(3) 0.2M PH9.5碳酸鹽緩沖液:3 ?! $ z* p7 ]" g& X. E) z( f

Na2CO3 0.32克; s3 C. i! A5 q1 G/ w4 {

NaHCO3 0.586克: H% E M! O w- M

加蒸餾水至50ml

再用蒸餾水作20倍稀釋,即成0.01M PH9.5的碳酸鹽緩沖液。

(4) NaBH4溶液(4mg/ml):

臨用時稱取NaBH44mg溶于1ml蒸餾水中。

(5) 其它的試劑及器材可參見戊二醛標記法。

3.工作濃度的選擇

在免疫酶技術中,首先要確定的變異因素就是酶標記物的工作濃度。因為酶標記物濃度的很小變化,便可導致試驗結(jié)果產(chǎn)生很大的波動。另外,由于濃度過高,可使非特異性反應增加,而濃度過低又可影響測定的敏感性。因此,正式試驗前必須準確滴定其工作濃度。

酶標記抗體的滴定方法是:將抗原(或抗體)物理吸附于固相載體上,然后將經(jīng)過一系列稀釋的酶標抗體(或抗Ig抗體)與吸附在載體上的抗原(或抗體)起反應,以酶與底物的顯色反應程度來確定酶標記抗體的效價,或稱工作濃度。

其步驟為:先將抗原(或抗體)用0.05M PH9.6包被緩沖液稀釋為10μg/ml左右,于聚苯乙烯板孔內(nèi)加0.1ml,4℃過一夜,次日以洗滌緩沖液洗滌3次。酶標記抗體用1%BSA-PBS液依次稀釋成1∶100,1∶200,1∶400,1∶800,1∶1600……(根據(jù)據(jù)抗體的滴度而定),分別加入反應孔中,每個稀釋度二孔,每孔0.1ml,37℃孵育1小時后洗滌。然后加底物液,每孔0.1ml,37℃10~30分鐘。以2M H2SO4 0.05ml終止反應。

結(jié)果判定主要以ELISA比色儀讀取各孔OD值。并以OD為縱座標,結(jié)合物濃度為橫座標,繪制滴定曲線。由曲線上查得OD值為1.0左右,且曲線斜率zui大時的酶標抗體稀釋度,即為該標記物的工作濃度。

有關試驗的試劑及器材均見ELISA部分。

C要說明的是,本法為ELISA直接法,所測的工作濃度與在實際應用中的zui適濃度可相差幾個滴度。這就要求在建立ELISA實驗系統(tǒng)中,因此基礎上還應進一步確定實際工作濃度(可采用方陣法),以達到zui適的實驗條件。

ELISA實驗代測:ELISA免疫標記技術實驗原理

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